骨髓来源巨噬细胞分离提取和培养详解→

✨分离胫骨和股骨取2周龄的健康大鼠，断颈法处死；用超纯水清洗大鼠2次，再用75%酒精浸泡5 min，进行表面除菌处理；将消毒后的动物转运至超净工作台内；无菌条件下，用第一套无菌剪刀和镊子剪开腿部皮肤，充分暴露两侧股骨；更换第二套无菌剪刀和镊子，从大腿根部关节处和脚后跟关节处剪断，分离腿部肌肉，取出胫骨和股骨，将其放在含有PBS的培养皿内。 ✨冲洗骨髓更换第三套无菌剪刀和镊子，清理胫骨和股骨表面残留的肌肉组织，注意保证骨头完整；留取纯净骨头，将其转移至新的含有PBS的培养皿内；取一个新培养皿，加10 mL大鼠骨髓来源巨噬细胞完全培养基备用；更换第四套无菌剪刀和镊子，先用镊子固定骨头，再用无菌剪刀剪下骨头两端；用注射器吸取培养皿内的完全培养基，从骨头一端插入针头，反复冲洗骨髓至骨头发白透亮，将骨髓液收集在培养皿内；用5 mL移液枪反复吹打骨髓液，将骨髓液经200目细胞筛过滤，滤液收集于离心管内，离心弃上清，获得骨髓细胞沉淀。 ✨巨噬细胞诱导分化用含M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的培养基刺激骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞。 M-CSF有两种获取方式：购买商品化的M-CSF因子。M-CSF的常用浓度范围为10-50 ng/mL，不同品牌的细胞因子使用浓度可能有所差异，需根据实际诱导效果调整使用浓度；使用培养5-7天的L-929细胞上清。将获得的L-929细胞培养上清高速离心除杂，分装后置于-20℃冷冻保存。通常使用含有20% L-929细胞上清的完全培养基进行诱导，同时可根据实际诱导效果，调整L-929细胞上清的含量。骨髓原代巨噬细胞骨髓来源巨噬细胞巨噬细胞的提取